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  • 氟西汀抑制氧糖剥夺复氧诱导BV2细胞炎性激活的作用及机制研究

    时间:2017-12-26 11:11:04 作者:知网查重入口 阅读:


     NF-κB炎性信号通路与脑缺血再灌注引起小胶质细胞(MicrogliaMG)炎性反应密切相关,炎性激活状态下的MG会分泌炎性因子,从而对神经元产生炎性损伤,因此,NF-κB信号通路的研究,对于脑缺血患者的临床治疗具有重大意义,而从核转录因子NF-κB活性调节的各种蛋白因子入手,开发具有靶向功能的抗炎药物,始终是脑缺血治疗药物开发的研究热点。NF-κB炎性调控通路主要包括IKK/IκB/NF-κB三个主要环节,因而IκB也成为众多抗炎药物研究的靶点。氟西汀(Fluoxetine)属于单胺类药物,主要用于受损神经功能的改善,有研究表明氟西汀可以通过抑制MG的免疫炎性反发挥其对神经元的保护作用,但对其抗炎的作用机制,尚未有过深入的研究。绝大多数炎性诱导物,如脂多糖等几乎都通过抑制IκBα的表达或者促进其降解,迅速有效活化NF-κB,因而,抑制IκBα的降解,可以有效抑制炎性反应的激活。本研究将建小鼠小胶质细胞BV-2体外氧糖剥夺/复氧模型(Oxygen glucose deprivation/reoxygenationOGD/R),对Fluoxetine的抗炎作用和机制做出深入的研究,为脑缺血类疾病的临床治疗药物开发提供坚实的理论基础。

    氟西汀抑制氧糖剥夺复氧诱导BV2细胞炎性激活的作用及机制研究

     

    内容:

    1. Fluoxetine抑制OGD/R诱导的BV-2细胞炎性反应的作用

    方法使用二甲基亚砜Dimethyl sulfoxideDMOS配置Fluoxetine母液10mM,然后对数生长期的BV-2细胞接种96孔细胞培养板,正常条件37℃和5%CO2过夜培养,加入使用终浓度(0,1,2.5,5,1020μM)的Fluoxetine,继续培养24小时,后CCK-8Cell Counting Kit)法检测细胞活性,根据细胞的A450值,分析比较各组细胞增殖活性,将无明显细胞毒性的Fluoxetine使用浓度作为后续实验的高剂量使用浓度。使用低中高三组剂量的Fluoxetine预处理对数生长期的BV-2细胞2小时,然后进行OGD/R诱导,复氧后24小时收集细胞上清、酶联免疫法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测其中炎性因子TNFα,IL-1βIL-6含量;同时收集细胞,Trizol裂解提取细胞总RNA,荧光定量(RealTime-PCR)检测胞内TNFα,IL-1βIL-6 基因mRNA含量收集细胞,提取细胞总蛋白并通过BCA法进行蛋白定量,免疫印迹(Western blotting)检测胞内NF-κB两组亚基p65p50的磷酸化。

    结果:CCK-8检测数据显示,Fluoxetine处理BV-2细胞24小时,20μM处理组BV-2细胞增殖活性明显低于细胞对照组或者溶媒对照组,差异具有统计学意义(P0.05),而其他浓度处理组细胞增殖活性与对照组或者溶媒对照组比较,无明显差异(P0.05)。ELISA检测结果显示,OGD/R处理能够明显增强BV-2细胞上清中TNFα,IL-1βIL-6三组炎性因子含量,与细胞对照组或者溶媒对照组比较,差异具有统计学意义(P0.01),Fluoxetine预处理且OGD/R处理组与OGD/R处理组比较,TNFαIL-1βIL-6蛋白含量均有所降低,其中,大剂量Fluoxetine预处理(10μM)且OGD/R诱导组与OGD/R或者OGD/R+溶媒对照组比较,炎性因子含量明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);检测数据还表明,Fluoxetine低、中和高剂量处理且OGD/R诱导组细胞上清中炎性因子含量呈依次降低趋势;OGD/R+溶媒与OGD/R组相比较,细胞上清中炎性因子含量无明显差异(P0.05)。RealTime-PCR检测数据表明,细胞内炎性因子TNFα,IL-1βIL-6基因mRNA相对含量,各组间趋势与上清中的炎性因子完全一致。蛋白检测数据显示OGD/R诱导能够明显增强BV-2细胞内p65p50蛋白磷酸化,与对照组比较,差异具有统计学意义(P0.05),Fluoxetine预处理且OGD/R诱导组,两组蛋白磷酸化与OGD/R组或者OGD/R+溶媒组比较,均有所降低,其中,大剂量Fluoxetine处理组细胞内两组蛋白磷酸化程度与OGD/R或者OGD/R+溶媒组比较,明显降低,组间差异具有统计学意义(P0.05);Fluoxetine预处理且OGD/R处理组,两组蛋白磷酸化程度随着Fluoxetine 剂量的增大而降低;OGD/R+溶媒与OGD/R组相比较,胞内两组蛋白磷酸化无明显差异(P0.05)。

    2. FluoxetineIκBα的结合验证

    方法分子模拟,是通过位点预测和分子探针表面扫描方法,获得蛋白潜在结合位点的结构信息,并计算特定配体的结合能力和分子间作用方式。借助生物信息学软件,我们对FluoxetineIκBα的结合位点信息做了预测和分析。在FluoxetineIκBα二者结合位点预测数据基础上,建立实验体系,通过依赖于靶点稳定性的药物亲和反应Drug Affinity Responsive Target StabilityDARTS实验证实二者直接结合的关系。FluoxetineIκBα直接结合对于胞内IκBα蛋白含量有什么影响,通过使用蛋白酶体抑制剂G132或者放线菌酮CHX处理BV-2细胞,分别抑制蛋白的降解和合成途径,后在不同时间(01248小时)收集细胞并提取总蛋白蛋白,Western blotting检测IκBα蛋白含量,实验分为细胞对照组和Fluoxetine高剂量(10μM)处理组

    结果:分子模拟对接数据显示,FluoxetineIκBα有多组可能的结合位点。而DARTS实验证实,在不加蛋白酶以及加入1:521:26(mg/L)的蛋白酶处理后,对照组及溶媒组IκBα蛋白含量依次降低,而Fluoxetine处理组IκBα含量则无明显变化。泛素化实验检测数据则表明,抑制蛋白降解途径后,对照组及Fluoxetine处理组BV-2细胞内IκBα蛋白含量随时间延长均有所增强;抑制蛋白合成后,对照组BV-2细胞内IκBα蛋白含量随着时间的延长则逐渐降低,Fluoxetine处理组细胞内IκBα蛋白随时间延长,无明显降低趋势。

    3. 阐述Fluoxetine通过抑制IκBα泛素化抑制NF-κB激活的炎性调控途径

    方法:针对小鼠IκBα基因设计siRNA序列并构建siRNA表达载体及重组慢病毒,通过病毒途径在BV-2细胞中进行IκBα基因敲减,获得IκBα基因敲减及亲本细胞,分别对两株细胞进行Fluoxetine预处理和OGD/R处理,复氧后24小时收集细胞上清,ELISA检测炎性因子TNFα,IL-1βIL-6含量;同时,收集细胞,提细胞总蛋白,检测NF-κB两组亚基p65p50的磷酸化以及IκBα蛋白表达

    结果:测序结果表明,成功设计siRNA序列并构建siRNA表达载体。病毒感染后72小时,通过荧光标记物绿色荧光蛋白(The green fluorescent proteinGFP)观察,确认BV-2细胞的慢病毒感染效率接近100%Realtime-PCR检测数据显示,Lv-shRNA-IκBα感染组细胞内IκBα基因mRNA含量明显低于细胞对照组、病毒对照感染组(Lv-control)或者错译序列(Negative Control,NC)感染组(Lv-NC),数据具有统计学差异P0.05),三组对照组BV-2细胞内IκBα基因mRNA含量则无明显差异P0.05)。ELISA检测结果显示,OGD/R处理后24小时,BV-2细胞上清中TNFα,IL-1βIL-6三组炎性因子含量,明显高于对照组或者溶媒对照组,差异具有统计学意义(P0.05),Fluoxetine预处理且OGD/R处理组,与OGD/R处理组比较,三组炎性因子含量与OGD/R组比较,明显降低(P0.05),Lv-shRNA-IκBα感染且Fluoxetine预处理且OGD/R处理组,细胞上清中三组炎性因子含量明显高于Fluoxetine处理且OGD/R处理组或者Lv-NC感染且Fluoxetine预处理且OGD/R处理组,组间差异显著(P0.05),Lv-NC感染且Fluoxetine预处理且OGD/R处理组与Lv-shRNA-IκBα感染且FluoxetineOGD/R处理组相比较,炎性因子含量无显著差异(P0.05)。Western blotting检测数据显示,OGD/R处理能够明显增强BV-2细胞中p65p50蛋白磷酸化,同时抑制IκBα蛋白表达,与对照组或者溶媒对照组比较,数据均具有统计学差异(P0.05),Fluoxetine预处理且OGD/R处理组,胞内p65p50蛋白磷酸化以及IκBα蛋白表达量与OGD/R组比较,显著降低和上升(P0.05),Lv-shRNA-IκBα感染且Fluoxetine预处理且OGD/R处理组,p65p50蛋白磷酸明显高于Fluoxetine预处理且OGD/R处理组或者Lv-NC感染且Fluoxetine预处理且OGD/R处理组细胞,IκBα蛋白表达明显低于Fluoxetine预处理且OGD/R处理组或者Lv-NC感染且Fluoxetine预处理且OGD/R处理组,组间差异显著(P0.05),Lv-NC感染且Fluoxetine预处理且OGD/R处理组与Lv-shRNA-IκBα感染且Fluoxetine预处理且OGD/R处理组相比较,无论p65p50蛋白磷酸化,还是IκBα蛋白表达,均无显著差异(P0.05)。

    结论

    本文主要研究了FluoxetineOGD/R诱导的BV-2细胞炎性反应的抑制作用及调控机制。研究中我们首先明确了Fluoxetine抑制BV-2细胞OGD/R炎性激活的作用,且呈剂量依赖。机制研究表明,Fluoxetine的抗炎作用与核转录因子NF-κB的激活有关,Fluoxetine抑制NF-κB激活是通过抑制IκBα的泛素化来实现的。分子对接表明,IκBα蛋白结构具有Fluoxetine多个理论结合位点,而DARTS实验证实,FluoxetineIκBα可以直接结合,蛋白泛素化实验证实FluoxetineIκBα直接结合可以抑制其泛素化,使BV-2细胞内IκBα蛋白表达维持在一个比较高的水平,从而与p65p50亚基结合成为三聚体,抑制胞内NF-κB的激活,使NF-κB/IκB炎性通路处静默状态。

    FluoxetineIκBα蛋白直接结合并抑制其泛素化,Fluoxetine的抗炎作用找到合理解释,这Fluoxetine用于缺血性脑损伤引起的MG炎性激活及神经元细胞损伤,无疑具有重大的意义。

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